免疫熒光雙標三色掃描全套（切片）

服務介紹：

抗原抗體的結合非常特異。免疫熒光雙標是用兩種不同種屬來源的抗體共同孵育同一張組織切片，兩種抗體分別與兩種目標蛋白特異性結合，然后再用帶有不同顏色的熒光染料標記的第二抗體分別與其對應的第一抗體結合，在組織切片掃描儀或者熒光顯微鏡下用對應波長的光去激發染料發出兩種不同的熒光，進而將兩種不同目標蛋白通過間接標記的方式用兩種熒光顯示出來。也可以利用TSA技術進行熒光標記，有信號放大的作用同時可以不限制一抗的種屬，同源或異源一抗都可以標記。TSA技術主要原理為用HRP標記的第二抗體與第一抗體結合后，再孵育熒光標記的酪胺（TSA），TSA在二抗上偶聯的HRP與H₂O₂的作用下變為活化的酪胺并附著在目標蛋白周圍的蛋白酪-氨酸殘基上，此結合是共價結合。而一抗與靶標、二抗與一抗之間是非共價結合。通過高溫和微波處理，非共價結合的一抗二抗被打斷并洗脫掉，而共價結合的熒光酪胺依然附著在靶標周圍，進而將靶標通過熒光標記顯示出來。每輪標記都按一抗-二抗-TSA的順序對相應抗原進行標記，每輪染色只需改變TSA熒光染料種類即可實現多個靶標用不同熒光染料進行共同標記。在組織切片掃描儀或者熒光顯微鏡下用熒光染料對應波長的光去激發染料發出熒光進而將目標蛋白通過間接標記的方式顯示出來。

 切片數字掃描是通過控制顯微成像系統和切片以一定的規則運動，采集多張連續的高分辨率顯微圖像再無縫拼接生成一張高分辨率的組織切片全景圖像。該圖像包含了玻片上所有的信息，可在電腦上用瀏覽軟件任意放大和縮小，任意部位觀察采圖，是真正脫離顯微鏡的閱片方式。通過在掃描儀上加載與免疫標記時熒光染料匹配的最佳激發波長和發射波長的濾光塊，獲取不同熒光通道的圖像。可單通道，多通道任意組合瀏覽并按需采圖。

送樣運輸要求：

1、組織樣本放置于10倍樣本體積的通用型組織固定液中固定24h以上，常溫保存運輸石蠟包埋切片或者冰凍切片。置于固定液內的組織切勿冷凍結冰，切勿固定時間過長。細胞爬片用通用型組織固定液固定，封口膜封好防止漏液，常溫保存運輸。

2、石蠟切片常溫保存運輸。冰凍切片-20°保存運輸。

實驗大體流程：

熒光二抗法：

石蠟切片脫蠟至水（冰凍切片和細胞爬片無需此步）——微波抗原修復——畫圈血清封閉——同時孵育兩種異源一抗——同時孵育對應種屬的兩種熒光二抗——DAPI染核——自發熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。

TSA法

石蠟切片脫蠟至水（冰凍切片和細胞爬片無需此步）——微波抗原修復——畫圈雙氧水封閉——血清封閉——孵育第一種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——微波處理——血清封閉——孵育第二種一抗——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA ——DAPI染核——自發熒光淬滅——抗熒光淬滅封片劑封片——掃描全景成像。 

熒光二抗法實驗具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液（PH 6.0 檸檬酸；PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修復盒中于微波爐內進行抗原修復。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修復液種類和修復條件根據組織來確定，優先推薦 PH 6.0 檸檬酸修復液）。

3、畫圈血清封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

4、加兩種異源一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的兩種一抗，切片平放于透明濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）。

5、加對應種屬熒光素標記的二抗（常用iF488和CY3標記的二抗）：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內滴加與兩種一抗分別對應種屬的熒光素標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

6、DAPI復染細胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

7、自發熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

8、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

9、鏡檢成像：切片置于玻片數字掃描儀下掃描全景成像。各種熒光素顏色及激發與發射波長見下表。

TSA法實驗具體流程：

1、石蠟切片脫蠟至水：依次將石蠟切片放入環保型脫蠟液I 10min-環保型脫蠟液II 10min-環保型脫蠟液III 10min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-無水乙醇Ⅲ 5min-蒸餾水洗。

2、抗原修復：組織切片置于盛滿抗原修復緩沖液（ PH 6.0 檸檬酸； PH 9.0 EDTA；PH 8.0 EDTA）的抗原修復盒中于微波爐內進行抗原修復。維持緩沖液沸騰10min左右，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min(修復液種類和修復條件根據組織來確定）。

3、畫圈, 雙氧水封閉：切片稍甩干后用免疫組化筆在組織周圍畫圈（防止試劑流走），切片平放于避光濕盒滴加3%雙氧水溶液，室溫避光孵育25 min左右，封閉內源性過氧化物酶。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

4、血清封閉：切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

5、加第一種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的第一種一抗，切片平放于透明濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）。

6、加對應種屬HRP標記二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

7、加iF555-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF555-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

8、微波處理：組織切片置于盛滿PH 6.0 檸檬酸修復液的修復盒中于微波爐內加熱處理維持沸騰10min左右去掉已經結合到組織上的一抗二抗，此過程中應防止緩沖液過度蒸發，切勿干片。

9、血清封閉：切片平放于透明濕盒滴加血清室溫封閉30min。一抗是山羊來源用10%兔血清封閉，一抗其它來源的用3%BSA封閉。

10、加第二種一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用無菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光濕盒內4°C孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）。

11、對應的HRP標記的二抗：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加與一抗相應種屬的HRP標記的二抗覆蓋組織，室溫孵育50min。

12、加iF488-TSA：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加iF488-TSA，避光室溫孵育10min。 孵育完后，將玻片置于TBST中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

13、DAPI復染細胞核：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

14、自發熒光淬滅：切片稍甩干后將切片平放于避光濕盒在圈內加入自發熒光淬滅劑5min，流水沖洗10min。

15、封片：將玻片置于PH7.4 PBS中在鐘擺搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。

16、鏡檢成像：切片置于玻片數字掃描儀下掃描全景成像。