ELISA實(shí)驗(yàn)代測：ELISA免疫標(biāo)記技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理

免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的免疫檢測技術(shù)被稱為3大免疫標(biāo)記技術(shù)。目前，使用的免疫標(biāo)記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。

1.原理

辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)

辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀(jì)30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結(jié)晶。本實(shí)驗(yàn)是以辣根為原料，經(jīng)過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級(jí)分離，再經(jīng)鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。

辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質(zhì)，HRP廣泛分布于植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，Mr在40000左右，等電點(diǎn)7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對(duì)愈創(chuàng)木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內(nèi)穩(wěn)定，加熱到63℃，在15min內(nèi)穩(wěn)定。氧化還原電勢很低，pH6.08時(shí)，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時(shí)，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b

酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。

酶制劑及其底物

凡無毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶，原則上均可作為標(biāo)記用。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿足下列要求：

(1)來源方便，易于純化;

(2)比活性高，性質(zhì)穩(wěn)定;

(3)酶活性和量能

用簡單方法測定。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。

由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩(wěn)定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右(zui高可達(dá)3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變。

HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:

HRP2 ~2 y( w9 E+ M

DH2+H2O2────→D+2H2O

供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB(3.3-二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現(xiàn)已很少應(yīng)用。OT(鄰聯(lián)甲苯胺)的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應(yīng)中使用的H2O2不能過量。應(yīng)控制在經(jīng)較短時(shí)間反應(yīng)后呈色即達(dá)高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時(shí)間也不會(huì)增加反應(yīng)產(chǎn)物的顏色。

酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)不同可采用不同的方法。對(duì)于制備HRP結(jié)合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

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2.實(shí)驗(yàn)步驟

HRP的制備

1).水提取：稱取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機(jī)中絞碎1～2次。碎渣漿用1倍體積的水低溫下攪拌提取過一夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干機(jī)(或離心機(jī))甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測得總體積。

2).硫酸銨分級(jí)分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當(dāng)于0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內(nèi)加完，置冷室中放置過一夜。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當(dāng)硫酸銨全部溶解后，置冷室過一夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機(jī)中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內(nèi)，放在流動(dòng)自來水中進(jìn)行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進(jìn)行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機(jī)中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液的體積。

3).丙酮分級(jí)分離：將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細(xì)滴管沿杯壁加入1倍體積預(yù)冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機(jī)中以4000r/min離心15min，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮，(操作同上)，靜置后，在冰凍離心機(jī)中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除去丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。

4).精制：將上步酶液適當(dāng)稀釋，滴加1mol/L硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10 -3 mol/L，5 000r/min離心10min，得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合并，分裝于透析袋內(nèi)，用水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進(jìn)行真空冰凍干燥(約得20mg)，產(chǎn)品呈米黃色纖維狀松軟物，HRP產(chǎn)品的RZ值可達(dá)3.0左右，置真空干燥器中低溫保存。

(1)戊二醛二步法)

1) 原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價(jià)結(jié)合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結(jié)合物。

2)標(biāo)記步驟：

(1) 稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中，于室溫靜置過一夜。

(2) 反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。

(3) 將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。

(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時(shí)。)

(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時(shí)。

(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時(shí)。

(7) 3000rpm離心半小時(shí)，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。

3)結(jié)果判定：

(1) 定性及效價(jià)滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標(biāo)記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)或免疫電泳試驗(yàn)。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。zui后以直接ELISA法(或在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里)對(duì)酶結(jié)合物進(jìn)行滴定( 見本節(jié) (三)工作濃度的選擇)。

(2) 定量和克分子比值測定：可用分光光度計(jì)測定(光程1cm)。

酶量(mg/ml)=OD403nm×0.48

IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62& I3 X) m+ {) X- E$ M

酶量(mg/ml)　　 IgG量(mg/ml) 　　酶量

克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 49

40,000 　　　　　　160,000　　　IgG量

(3) 本法標(biāo)記步驟比較簡單，重復(fù)性好。缺點(diǎn)是酶的利用率低，一般只有2~4%的酶與蛋白質(zhì)結(jié)合。

4)試劑及器材：

(1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。

(2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。

(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。

(4) 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。

(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。

(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。

(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。

(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。

(9) HRP(RZ>3.0)。

(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。

(11) 攪拌器，分光光度計(jì)，離心機(jī)。

(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。

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(2)簡易過碘酸鈉法% E0 O+ v: s2 T

本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結(jié)合，所獲酶標(biāo)記抗體的產(chǎn)率高，將近70%的HRP和Ig結(jié)合，99%的Ig與酶結(jié)合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前zui常用的方法。

1)原理：

經(jīng)典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯(lián)。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經(jīng)NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進(jìn)一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。

8 n% @9 _& U8 s6 V2)標(biāo)記步驟:

(1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。

(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。

(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對(duì)1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過一夜。

(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時(shí)。

(5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時(shí)。

(6) 將上述液裝入透析袋中，對(duì)0.15M PH7.4 PBS透析，4℃過一夜。

其余步驟(純化)同戊二醛標(biāo)記步驟的(6)、(7)、(8)。

3)結(jié)果判定：

除標(biāo)記物IgG量的計(jì)算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。

IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62

4)試劑及器材:

(1) 0.1M NaIO4：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)830602)溶于蒸餾水10ml中。

(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液

0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml

0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml

加蒸餾水至2,000ml。

(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:3 ?! $ z* p7 ]" g& X. E) z( f

Na2CO3 0.32克; s3 C. i! A5 q1 G/ w4 {

NaHCO3 0.586克: H% E M! O w- M

加蒸餾水至50ml

再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。

(4) NaBH4溶液(4mg/ml):

臨用時(shí)稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。

(5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標(biāo)記法。

3.工作濃度的選擇

在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動(dòng)。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。

酶標(biāo)記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標(biāo)記抗體的效價(jià)，或稱工作濃度。

其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過一夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個(gè)稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時(shí)后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應(yīng)。

結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以O(shè)D為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時(shí)的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。

有關(guān)試驗(yàn)的試劑及器材均見ELISA部分。

C要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實(shí)際應(yīng)用中的zui適濃度可相差幾個(gè)滴度。這就要求在建立ELISA實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)一步確定實(shí)際工作濃度(可采用方陣法)，以達(dá)到zui適的實(shí)驗(yàn)條件。

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